間充質幹細胞/間充質基質細胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells, MSC）的體外規模化擴增，是細胞治療產業化的重要基石。在再生醫學的璀璨星河中，MSC無疑是最引人注目的明星之一——它們擁有自我更新的能力、卓越的免疫調節功能以及促進組織再生的潛能，為治療多種難治性疾病帶來了希望。

長期以來，傳統的體外細胞培養主要聚焦於可溶性化學因子（如細胞因子和生長因子）的研究，認為這些可溶成分是調控細胞行為的主要因素，因此在培養基及添加物的優化方面召开了大量工作。然而，體內天然細胞微環境的複雜性遠超於此：它不僅包含可溶性生化信號，還包括不溶性的細胞外基質（Extracellular Matrix, ECM）組分。這些基質既能给予固相化的化學信號，又能傳遞重要的生物物理信號，如拓撲結構、剛度和空間構型[1]。這些理化特性深刻影響着細胞的黏附、增殖、分化及組織形成[2]。

可以說，細胞、信號分子和細胞外基質三者共同調控着組織的發育與再生[3]。因此，在體外細胞培養中，除了細胞這一「主角」之外，配角也不再僅限於培養基等可溶成分。能夠模擬天然細胞外基質關鍵特徵的生物材料，早已成為不可或缺的重要角色，有助于着細胞培養從傳統的平面培養平台向三維（3D）培養體系轉變，從而縮小簡易體外實驗與複雜體內生物學之間的差距[4]。

本文將從機械生物學（Mechanobiology）與仿生學視角，深度剖析微環境如何重塑MSC狀態、強化其旁分泌效能，並思考在規模化生產中，韦德国际應如何選擇真正的3D培養策略。

一、MSC的「生態系統」：微環境決定細胞命運

MSC在體內並非孤立存在，它們棲身於一個複雜的「生態系統」——幹細胞微環境（niche）之中。這個微環境主要包括：

• 細胞外基質：给予物理支撐和固相化的生化信號；
• 鄰近細胞：免疫細胞、內皮細胞等形成的細胞間通訊網絡；
• 可溶性因子：細胞因子、生長因子等生化信號；
• 物理化學梯度：氧氣、營養、代謝產物的空間分佈。

大量研究表明，微環境的穩定性直接決定了MSC的增殖、分化和功能狀態[5]。換句話說，MSC的「命運開關」，就藏在微環境之中。

二、二維培養的困境：當細胞被「誤導」而衰老

在傳統的體外細胞擴增中，基於塑料培養皿或培養瓶的單層培養工藝（monolayer，以下簡稱2D培養）存在的問題，遠不止「效率低」這麼簡單。更深層次的問題是：它改變了MSC的生物學本質。

在2D培養環境中，MSC被迫經歷形態上的強制拉伸（扁平化）、細胞極性改變、細胞-細胞接觸減少以及機械信號的異常傳導。長期如此，會導致分化能力下降、免疫調節功能減弱、細胞衰老加速等一系列不良後果。

已有研究指出，2D培養正顺利获得非生理性的機械力學微環境，悄然誘導細胞的表型漂移與衰老。聚苯乙烯培養皿的楊氏模量（Young’s Modulus）高達約3 GPa，而人體天然軟組織（如骨髓、脂肪微環境）的硬度通常在0.1～100 kPa之間。這種指數級的力學差異，將MSC置於極端的機械應激狀態[1]。

▲圖 二維、三維貼附狀態對比圖

（左：3D培養，右：2D培養）

異常鋪展與細胞骨架強直

在超硬基底上，MSC被迫產生極高的細胞內張力，表現為應力纖維的大量組裝和極度扁平的「煎蛋樣」形態。這種病理性肥大導致細胞核受到嚴重的機械壓迫，進而改變了染色質的超微結構。

細胞周期停滯與複製性衰老

高基質剛度相關的2D培養環境及長期陆续在傳代，被認為可顺利获得增強細胞骨架張力與機械信號轉導，加速MSC的衰老進程。研究表明，在體外擴增過程中，MSC會逐漸出現端粒縮短、細胞增殖能力下降以及細胞周期向G0/G1期偏移等典型複製性衰老特徵。同時，衰老MSC常伴隨氧化應激水平升高及脂質過氧化增強，例如丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等相關指標的積累，這些變化與細胞功能下降及衰老表型維持密切相關[7]。

衰老相關分泌表型的毒性累積

進入複製性衰老的MSC不僅喪失增殖與分化能力，還會分泌大量促炎因子（如IL-6、IL-8）及基質金屬蛋白酶（MMPs），即形成衰老相關分泌表型（SASP）。SASP不僅削弱了MSC的免疫調節功能，還會顺利获得旁分泌途徑加速整個培養體系的微環境惡化[8]。

這種被視為「常規」的培養方式，可能導致MSC功能性下降和表型改變[6]。也或許在一定程度上解釋了，為什麼很多臨床前研究結果令人鼓舞，但在規模化生產後療效卻變得不穩定。

三、三維微環境：從機械重塑到抗衰老

與2D培養形成鮮明對比的是，3D微環境顺利获得調節細胞骨架、激活抗衰老通路與自噬機制，將細胞重塑為更具活力、更接近生理狀態的存在，從而顯著逆轉二維培養引發的細胞異態。

生長方式與骨架重塑：告別「攤大餅」

在2D貼壁培養中，極高的基底剛度強制誘導細胞鋪展，細胞骨架沿二維平面無限延展[1]。這種「攤大餅」式的生長方式導致細胞表觀直徑非生理性增大（在高代次細胞中尤為明顯），同時細胞骨架嚴重僵化——這正是二維培養細胞隨代次增加逐漸衰老、直徑異常增大的根本原因[7-8]。

相比之下，3D微環境（如微載體或細胞球）從底層改變了細胞的生長方式。彈性的三維空間限制了細胞的過度鋪展，MSC在此環境中骨架排列更加靈活，形態得以恢復至接近體內生理狀態[9]。這種三維約束使得MSC的細胞直徑實現「生理性回歸」，通常穩定在最具活力和分化潛能的黃金區間[10]，保留了更高的核質比。此外，3D球體培養還能賦予細胞更強的物理形變能力，從而大幅提升其微循環顺利获得率，降低靜脈回輸時的栓塞風險[9]。

細胞周期解救與衰老標誌物清除

多項研究表明，3D球體培養可顯著改善MSC的衰老表型。在該培養體系中，衰老相關標誌物如SA-β-gal表達水平下降，細胞周期阻滯現象減輕（G0/G1比例降低），同時細胞增殖能力與功能狀態得到部分恢復。這些變化提示三維微環境可能顺利获得重塑細胞-細胞及細胞-基質相互作用，從而緩解MSC的複製性衰老過程[7]。

另一項研究採用了交替2D培養與3D球體培養的策略，結果顯示，相較於陆续在的2D培養，這種交替式培養能有效減緩MSC在長期擴增過程中的體積增大和衰老現象，進一步印證了3D微環境在維持細胞「年輕態」和功能性方面的獨特價值[11]。

SIRT1抗衰老與ALDH3抗氧化網絡的激活

多項研究表明，3D培養微環境可能顺利获得調控細胞氧化還原狀態及衰老相關信號通路，影響MSC的功能與衰老表型。在該條件下，部分與衰老相關的分子指標如SIRT1及p16INK4a可能發生表達水平變化，同時細胞內氧化應激狀態得到一定程度改善。此外，細胞抗氧化與醛類代謝相關體系的活性變化，也被認為可能參與脂質過氧化產物清除及ROS水平調控過程。總體而言，這些變化提示3D微環境可能顺利获得多通路協同作用減輕MSC的氧化應激負擔[7]。

物理張力釋放與YAP入核抑制

在3D多孔或懸浮環境中，黏着斑激酶（FAK）信號減弱，導致機械敏感轉錄因子YAP/TAZ從細胞核轉移至細胞質並被降解，從而卸下了維持細胞高度緊張的「物理枷鎖」[12-13]。

mTOR通路的負調控與自噬激活

3D微環境適度抑制了促衰老的mTORC1信號軸，溫和激活AMPK-ULK1主導的細胞自噬。這一「深度大掃除」機制高效清除了功能失調的線粒體（Mitophagy），這一調控網絡被認為在維持細胞穩態及調節衰老相關表型中發揮重要作用[14]。

▲圖 3D微環境抗衰老的分子信號通路圖

四、效能飛躍：旁分泌強化與外泌體產能爆發

在臨床應用中，MSC發揮療效的關鍵依賴於其旁分泌（Paracrine）機制。而3D培養，正將這一潛能推向了新的高度。

巨噬細胞M2極化與免疫調節因子的激增

最新研究揭示了MSC的免疫調節功能受到微環境力學信號的顯著影響。在三維培養或更接近生理狀態的環境中，細胞骨架張力及肌動蛋白（F-actin）組織方式發生改變，並可顺利获得調控YAP/TAZ等機械轉導相關信號通路，影響MSC的功能狀態。相關研究提示，這種力學調控可能進一步影響MSC對巨噬細胞極化方向的調節能力，使其更傾向於誘導抗炎表型，但其具體機制仍具有明顯的情境依賴性[8]。此外，3D培養可使吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、前列腺素E2（PGE2）及腫瘤壞死因子誘導基因6（TSG-6）的分泌量提升數十倍[15]。

外泌體產能躍升：無細胞療法的破局點

3D微環境顯著促進了多囊泡體（MVBs）與細胞膜的融合。當3D培養與動態生物反應系統相結合時，MSC外泌體的總產能相比傳統2D培養可實現驚人的20倍提升[16]。與此同時，3D培養來源的外泌體（3D-Exos）相比傳統2D來源的外泌體（2D-Exos）發生了顯著的內含物轉變，內部富集了更多與組織修復密切相關的特定miRNA，實現了產能與藥效的「雙核爆發」[17]。

▲圖 3D來源外泌體（3D-Exos）與2D來源外泌體（2D-Exos）的表徵分析

(A) 用於獲取培養上清並分離外泌體（EXO）的3D培養和2D培養MSC體系示意圖。

(B) 第4天時，在載細胞微凝膠（cell-loaded microgel）中進行3D培養的MSC活/死染色圖像。

(C) 2D-Exos和3D-Exos的透射電子顯微鏡（TEM）形態圖。

(D) Western blot代表性結果，顯示MSC、2D-Exos和3D-Exos中外泌體陽性標誌物（CD9、CD63和TSG101）及陰性標誌物（Calnexin）的表達情況。

(E) 2D-Exos和3D-Exos的產量比較。產量定義為：採用納米顆粒追蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）測得的分離樣品中外泌體顆粒總數，除以對應來源培養體系中的細胞數量。

(F) 2D-Exos和3D-Exos樣品的粒徑分佈及顆粒濃度分析。

五、破局之道：3D培養的仿生學原理

如今，研究人員已開發出多種能夠打破「2D魔咒」的3D培養技術。其中一種較為簡化的方式是球狀體（Spheroid）技術。該技術屬於無支架（即無生物材料參與）的3D培養方法，不给予任何固體黏附表面，而是將細胞懸浮於溶液中，依靠細胞自身聚集或藉助外力（如離心）強行促使細胞聚集成球狀體。該方法操作簡單，且能增強細胞-細胞間的相互作用。

對於在體內天然依賴細胞間連接的細胞類型（如上皮類細胞），這種強制的細胞-細胞相互作用無疑更接近天然狀態。然而，球狀體內部常形成梯度——表面細胞增殖活躍，中心細胞因營養匱乏而壞死，且球狀體之間難以標準化，缺乏細胞與細胞外基質的相互作用，與體內的真實環境仍有差距。MSC屬於基質細胞，其天然傾向是與ECM相互作用，過強的細胞-細胞接觸反而會引發接觸抑制，導致細胞增殖停滯。因此，儘管有研究表明MSC經球狀體培養後可減小細胞尺寸、改變細胞骨架重組[7]，但真正的3D仿生培養遠非簡單的「懸浮」所能概括。

那麼，什麼是真正的3D仿生培養？其本質在於從機械力學到生化梯度的全面模擬與還原，核心目標是重建MSC在體內所處的幹細胞生態位（Stem Cell Niche）。

顺利获得生物材料模擬ECM，是讓3D培養技術更進一步貼近仿生的重要手段。其中，水凝膠是一種將細胞均勻包裹在三維網絡中的培養方式[18]。這種方法可以模擬軟組織的力學特性，並支持細胞與基質間的相互作用。然而，對於大規模生產而言，從水凝膠中「收穫」細胞往往是一個破壞性過程，且細胞需要與水凝膠同時製備，批次間穩定性成為規模化生產的挑戰。解決水凝膠規模化生產問題的思路，是將生物材料製備與細胞接種拆分為兩步，即製成預製的生物支架。對於MSC及其他貼壁類細胞而言，預製的商業化微載體是现在最接近實現規模化生產、模擬細胞外基質的選擇[19-20]。

一個理想的3D仿生培養體系，應當具備以下核心要素：

01 空間自由度（Spatial Freedom）：

釋放Z軸的物理限制，允許細胞立體伸展。

02 連接模式的立體生化重塑（Adhesion & Matrix Shift）：

將2D環境中非生理性的、極度扁平的「細胞-人工硬質基底」重塑為三維立體交互：

細胞-細胞（Cell-Cell）通訊： 恢復N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）等介導的同源細胞連接。

細胞-天然基質（Cell-Endogenous ECM）包裹： 在3D微環境中，細胞不再只是貼附於塑料表面，而是能夠分泌並組裝自身的內源性ECM（如富含纖連蛋白和膠原的三維網絡），將自身與周圍細胞立體包裹，形成結構完整的仿生微組織（Micro-tissue）。

03 生化梯度（Biochemical Gradients）：

形成類似體內的氧分壓、營養物質和代謝產物的微小梯度。

六、規模化生產中的明智選擇

當韦德国际將目光投向臨床應用時，MSC的規模化生產面臨三大核心挑戰：如何保證細胞質量（維持乾性、避免衰老）、如何控制生產成本、如何確保工藝的可重複性和安全性。在這樣的背景下，3D多孔可降解微載體培養脫穎而出，成為符合產業化需求的優選方案。

從技術邏輯上看，韦德国际之所以強調這是「真正的三維」，是因為它同時滿足以下幾個關鍵條件：

仿生性與保護性：给予物理支撐和生化信號的雙重仿生，孔隙結構保護細胞免受過度機械損傷，維持乾性；

動態性：可與生物反應器結合，给予流體剪切力（Fluid Shear Stress, FSS）。在傳統的靜態2D培養中，細胞周圍的培養液幾乎不流動，而在生物體內，細胞間質液、血液和淋巴液的流動會產生流體剪切力——這是一種重要的機械刺激。研究表明，在動態培養系統（如生物反應器）中，適當的流體剪切力可以促進物質交換，同時顺利获得機械傳導途徑激活細胞內的信號通路，增強MSC的成骨分化或免疫調節能力[21]；

可降解性與可放大性：可降解的特性極大簡化了細胞收穫和分離工序，工藝參數明確，易於從實驗室規模放大至工業級生產。

而從商業邏輯上看，基於3D多孔微載體的培養工藝也正在重塑細胞藥物的產業化路徑：

01 降本增效：

在空間密度方面，一台50L的3D攪拌式生物反應器，其表面積產能可等效於數百個傳統的10層細胞工廠，極大地縮減了B+A級高等級潔淨廠房的面積需求。在人力成本方面，實現了從「勞動密集型」向「技術驅動型」的躍遷，人工成本呈斷崖式下降。

02 監管合規與獲批背書：

國內首款獲批上市的MSC藥物，正是運用了封閉、自動化、可線性放大的3D工藝。這表明，3D工藝已成為加速IND申報和實現商業化獲批的重要解決方案之一。

七、警惕「偽3D」：不是所有微載體都是真正的三維

在2D向3D工藝轉型的當下，企業往往容易陷入一個典型誤區——「偽3D培養」：即認為只要使用了微球或微載體體系，就等同於實現了三維培養。事實上，這一認知存在明顯偏差。

當前市面上湧現的多款可用於MSC培養的微載體，本質上仍屬於以下幾類結構：

實心微載體（Solid microcarriers）：結構類似「彈珠」，如聚苯乙烯塑料微載體；

微孔微載體（Microporous microbeads）：內部為亞微米級孔隙（submicron pores），如葡聚糖或其他糖類微載體；

褶皺微載體：表面具有坑狀或褶皺結構（類似「月球表面」），如部分蛋白類微載體；

大孔微載體（Macroporous microbeads)：蜂窩狀多孔微球，表面為十微米以上的開放式孔洞且內部孔隙連通，如3D可降解多孔微載體。

對於直徑通常在10–20 μm的MSC而言，前三種微載體（直徑約100–300 μm）並不能给予真正的三維生長空間。細胞仍然只能附着於外表面，發生極化並鋪展，形成單層生長結構。換言之，這類系統本質上仍是「帶曲率的二維培養」，而非真正的3D微環境。

真正能夠给予3D微環境的微載體，應具備一個關鍵特徵：大孔且連通的三維結構。當孔徑大於細胞尺寸時，細胞可以主動遷移進入孔隙內部，與多方向孔壁形成接觸，建立更接近體內的空間互作關係，從而打破二維培養中典型的「極化-鋪展」行為，恢復更生理性的狀態。

然而，需要強調的是：微載體的「孔徑」和「尺寸」並非越大越好——這是當前很多研發團隊容易忽視的第二個關鍵問題：

01 孔徑過大的問題：

當孔徑遠大於細胞尺寸時，細胞難以同時接觸多側孔壁，更傾向於單側附着，同時孔壁曲率降低，趨近於「平面」。其結果反而削弱了3D微環境的「包裹感」和空間信號調控能力。研究表明，足夠高的主曲率會促進細胞聚集，並在大孔內形成潛在的保護性生態位，防止MSC分化並保持其乾性，而曲率越低則越容易促進細胞分化[22]。

▲圖 支架大孔孔徑調控組織表型及基因表達（體外和體內）

（↑：上調，↓：下調）

02 微載體尺寸過大的問題：

更為關鍵的是，孔徑增大往往意味着微載體整體尺寸的增大，而這會直接觸及一個生理學的「硬限制」——物質擴散極限。大量研究表明，氧氣等關鍵分子的有效擴散距離約為100 μm左右[23]。根據Krogh Cylinder模型，單個毛細血管所能供養的氧擴散距離通常不超過200 μm[24]。當這一距離被突破時，氧氣無法有效到達中心區域，營養供應不足，代謝廢物積累，最終導致細胞進入缺氧甚至壞死狀態。

由此可以推導出一個關鍵的工程學結論：理想的3D培養結構，其特徵尺寸應控制在擴散極限以內。具體而言，微載體直徑建議不超過400 μm，更優範圍為200 μm左右，以確保任意細胞到「外界環境」的距離不超過200 μm，從而維持有效的氧氣與營養傳輸。

因此，在選擇真正的3D微載體體系時，需要同時關注兩個核心參數：孔徑（決定是否為3D） 和尺寸（決定是否可存活），二者缺一不可。而那些僅顺利获得表面粗糙化或微結構修飾的實心微載體，本質上只是增加了附着面積或擾動細胞形態——細胞依然是在「表面」進行鋪展生長，並未真正進入三維空間。

▲圖 微載體電鏡圖

（左：表面褶皺結構-「偽」3D，右：連通多孔結構-「真」3D）

從2D向3D的跨越，不僅是培養模式的變更，更是讓細胞回歸本源的過程。選擇真正的3D微環境體系，才能從源頭上還原體內仿生環境，徹底突破細胞治療與外泌體產能的效能瓶頸。正如Patrick Wuchter等人在綜述中所言：「為了真實模擬體內的生理狀況，先進的模型系統應基於排列在三維結構中的生態位細胞。」3D微環境不僅僅是給MSC換了一個「更大的房子」，更是给予了一個包含力學信號、拓撲結構和生化因子的精密調控系統。

在未來，當韦德国际進行MSC的科學研究或工業化生產時，應當跳出傳統的「平面思維」，優先選擇能夠真正模擬體內微環境的三維多孔微載體培養，這不僅是對細胞命運的尊重，更是通向臨床成功轉化的重要一步。展望未來，3D培養的應用不僅局限於提升細胞規模化生產的質量和數量，再生醫學的最小治療單元也將從「單細胞懸液」進階為攜帶豐富內源性ECM網絡的「3D微組織」——而這，將是另一個值得期待的話題。

關於韦德国际生物

北京韦德国际生物科技有限公司创建於2018年，源自清華大學科技成果轉化，由清華大學生物醫學工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建，先後獲評國家高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業等榮譽稱號，並多次取得國家科技部、工信部等部委多項重點研發專項支持。

作為高質量細胞製造專家，韦德国际生物擁有上萬平方米的研發及生產平台，基於3D微載體打造的原創3D細胞智造平台，可為客戶给予定製化一站式整體解決方案，助力實現千億量級細胞藥物及其衍生品的規模化、自動化、智能化、密閉化生產。產品與服務已廣泛應用於幹細胞、細胞外囊泡、疫苗及蛋白類製劑等產品的上游工藝開發，以及再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）等領域。

秉持「引領細胞產業化开展新時代」的願景，韦德国际生物持续參與行業標準建設，深度參與多項國家標準及團體標準的起草工作，並成功助力我國首款幹細胞藥物獲批上市，以及多家CGT企業完成IND申報獲批/受理，持續有助于細胞產業全球普惠开展。