嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）療法，作為CAR-T細胞療法之外最受矚目的「現貨型」細胞免疫治療手段，正在改變血液腫瘤的治療格局。然而，與CAR-T不同，NK細胞在患者體內的半衰期較短（約兩周，而異體NK細胞通常僅存活數天至數周，中位時間約7天），因此臨床方案往往需要高劑量（≥10⁷細胞/公斤體重）且反覆輸注才能維持療效。這就對NK細胞的體外製造能力提出了嚴苛要求：必須能夠以可接受的成本，生產出數十億乃至百億級別的高殺傷活性NK細胞。

中国科研实验室動物研究所的革命性突破

近期，中国科研实验室動物研究所王金勇研究員、張夢雲研究員與中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）竺曉凡研究員合作，在《自然·生物醫學工程》（Nature Biomedical Engineering, IF 26.6）上發表了一項里程碑式的研究（Hu et al., 2025，以下簡稱Hu等人）。

他們開發出一種創新的三步法，從臍帶血CD34+造血干/祖細胞（HSPCs）出發，實現了誘導NK細胞（iNK）和CAR-iNK細胞的超大規模、低成本生產，為「現貨型」NK細胞療法的普及應用鋪平了道路。

方法設計的初衷：超越現有技術瓶頸

現有的基於細胞因子的HSPC-NK分化體系，每個輸入HSPC僅能產生1,879-4,450個NK細胞，且終末細胞表達CD16的比例極低（僅約3%），嚴重限制了其抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）功能。同時，如何在CAR工程化與高效分化之間取得平衡，也是長期未解的難題。

研究團隊正是瞄準了這些瓶頸，設計了整合高密度HSPC擴增、類器官驅動的淋巴譜系特化以及後續NK成熟的一體化封閉系統工藝。

第一階段：HSPC的超級擴增（Day0 — Day14）

一切始於從臍帶血中分離的單個CD34+ HSPC。

研究人員將這些細胞與經照射處理的小鼠骨髓基質細胞系AFT024進行共培養，培養基中添加了優化的細胞因子組合（SCF、FLT3L、TPO等）。AFT024細胞作為滋養層，模擬了骨髓中的造血微環境，给予了促進HSPC自我更新而非分化的關鍵信號。

經過約14天的共培養，單個CD34+ HSPC可實現驚人的800至1,000倍的擴增，為後續分化儲備了海量的「種子細胞」。

基因工程的黃金窗口：值得注意的是，CAR基因的逆轉錄病毒轉導正是在這一早期階段進行的。由於細胞在擴增前就完成了工程化改造，所需的病毒載體用量被極大地降低——與傳統方法（轉導成熟NK細胞）相比，病毒用量減少了14萬至60萬

第二階段：無飼養層類器官中的譜系分化（Day14 — Day28）

擴增後的HSPCs被轉移至另一種小鼠骨髓基質細胞系OP9上共培養。關鍵在於，在這種共培養條件下，細胞會自發聚集，形成三維的無飼養層類器官聚集體（feeder-free organoid aggregates）。這種3D結構更真實地模擬了胚胎髮育期間的造血微環境，顺利获得細胞間的複雜相互作用（特別是Jagged1/Notch1信號通路的激活），高效地引導HSPCs向NK細胞譜系定向分化和發育。這是整個方法的核心創新點，巧妙地將飼養層細胞的支持作用與3D培養的結構優勢相結合。

第三階段：在透氣培養袋中的成熟與大規模擴增（Day28 — Day49）

從類器官中釋放出來的、已定向於NK譜系的細胞，被轉移至透氣性培養袋中，在IL-15和IL-2等細胞因子作用下，進入最後的成熟和擴增階段。透氣培養袋的設計允許大規模、封閉式的細胞擴增，符合臨床級生產的規範。

▲圖：從臍帶血CD34⁺造血幹細胞和祖細胞大規模生產iNK細胞與CAR-iNK細胞的「三步法」流程示意圖

圖片來源：王金勇教授實驗室

震撼業界的關鍵數據與突破性成果

僅需1/5個臍帶血單位，即可生產出數千劑治療產品。

Day42：從一個輸入的CD34+ HSPC出發，平均可產生1.4×10⁷ ± 0.1×10⁷（約1,400萬）個iNK細胞，或7.6×10⁶ ± 1.2×10⁶（約760萬）個CD19-CAR-iNK細胞。

Day49：終末收穫時，這一數字進一步提升至8.3×10⁷ ± 0.7×10⁷（約8,300萬）個iNK細胞，或3.2×10⁷ ± 0.2×10⁷（約3,200萬）個CAR-iNK細胞。

以一個典型的臍帶血單位含有1-2×10⁶個CD34+細胞計算，該平台理論上可生產出數萬億個CAR-iNK細胞——足以滿足數百名患者的治療需求，其產出的細胞質量和功能可達到：

高純度：終末產品中CD45⁺CD56⁺CD16⁺ NK細胞純度>99%，幾乎檢測不到T細胞污染，確保了安全性。

高CD16表達：與傳統細胞因子誘導方案（CD16陽性率僅約3%）不同，該方法產生的iNK和CAR-iNK細胞高表達內源性CD16，意味着它們具備強大的ADCC效應功能，可與治療性抗體聯合使用，發揮雙重殺傷機制。

廣譜抗腫瘤活性：無論是新鮮製備還是凍存復甦後的iNK和CAR-iNK細胞，均能有效殺傷多種人腫瘤細胞系。

持久的體內療效：在人B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）等多種腫瘤異種移植模型中，CD19 CAR-iNK細胞不僅抑制了腫瘤生長，更顯著延長了荷瘤小鼠的生存期。值得注意的是，即使在實體瘤模型中，凍存復甦後的CAR-iNK細胞在體內仍能維持長達六個月的腫瘤清除活性。

從實驗室突破到工業化生產

在這個突破性的培養技術中，NK培養階段（第三階段）已實現無飼養層體系純因子法的培養，然而要將這幅藍圖轉化為真正意義上的工業化、臨床普及產品，韦德国际仍需解決前兩階段的核心工藝瓶頸：異種（小鼠）飼養層細胞的使用。AFT024和OP9雖然功能強大，但它們帶來的安全性風險、監管障礙和工藝複雜性，是通往商業化GMP生產道路上的主要關卡。

以下，韦德国际整合最新的組織工程學和生物材料研究成果，提出一套將當前方案升級為「下一代」全封閉、自動化、無異種成分生產平台的優化路徑。

（註：這些改進建議僅是韦德国际對無限可能的暢想和對未來技術演變的期許，不代表成熟方案）

飼養層的人源化與可分離設計

人源間充質幹細胞（hMSCs）結合微載體

解決異種細胞問題的直接思路，是用人類來源的細胞替代小鼠細胞。

人源間充質幹細胞（hMSCs） 是骨髓微環境中支持造血干/祖細胞（HSPCs）的自然「培育者」。該研究證實，在臍帶間充質幹細胞（UC-MSC）飼養層和細胞因子（IL-2, IL-15, IL-3, FLT-3L）的共同作用下，臍帶血來源的NK前體細胞(progenitors)在培養兩周後實現了 64.7±8.4倍的擴增，顯著高於僅使用細胞因子的對照組（6.4±1.5倍）。研究還發現，UC-MSC與NK前體細胞之間的直接接觸對於促進擴增至關重要（Boissel et al., 2008）。

然而，即使是使用hMSCs做為共培養，且直接接觸的飼養層，如何將其與懸浮的HSPCs高效分離，是規模化生產必須解決的問題。

微載體技術恰好能解決這一難題。韦德国际可以在攪拌式生物反應器中，將hMSCs培養在直徑較大的多孔微載體上，從而構建一個動態且可放大的共培養系統。hMSCs會牢固地粘附在微載體上，而HSPCs則懸浮生長或進入微載體的孔隙內部。因此，當擴增階段結束時，只需顺利获得簡單的沉降或過濾，就能將二者高效分離——徹底告別複雜的流式分選或酶解消化步驟。

從類器官到仿生3D微環境

可溶解多孔微載體的實驗證據

當前方案的第二階段依賴OP9細胞形成的類器官聚集體來模擬骨髓微環境以促進HSPC向NK的分化和發育。而最新研究（Li et al., 2023；Liang et al., 2023）表明，韦德国际可以利用仿生學的3D微載體來復刻這一過程，甚至做得更好，同時有完全擺脫動物細胞依賴的潛力。

Li等人（2023）在《Nature Communications》中的研究簡化了3D微環境在擴增人類巨核系偏好的造血幹細胞（Mk-HSCs）的應用；

Liang等人（2023）在《Bioactive Materials》中的研究给予了關鍵證據：他們開發了一種基於明膠的可注射3D微凝膠（微載體）系統，將HSPCs與MSCs共培養於其中。這種仿生微支架（微載體）成功復刻了骨髓微環境，顯著增強了HSPCs的維持和功能，在急性致死輻射（9.0 Gy）的小鼠模型中，該策略展現出驚人的治療效果。

這兩篇文章的主要發現包括：

驚人的擴增效率：在最適培養條件下（攪拌速度40 rpm，培養3天），單純添加微載體（沒有共培養的細胞）可以分別將CD34⁺、CD34⁺CD38⁻、CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺以及CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺CD49f⁺ 等HSPC亞群擴增了6.2倍、6.5倍、20.8倍和179倍。這些結果證實了基於微載體的臍帶血HSC體外擴增體系具有良好的可放大性。

信號通路的精準調控：3D微環境（micro-Niche)結構有效刺激了Notch信號通路——而Notch信號的激活，恰恰是OP9細胞通常被用來觸發淋巴細胞分化的核心機制。3D物理約束與MSCs共培養協同作用，上調了血小板生成素（TPO）信號通路和巨核系相關基因的表達。

乾性維持：與2D培養相比，3D微環境中長期造血幹細胞（LT-HSCs）的頻率提高了3.5倍。

體內功能驗證：顺利获得微載體擴增的HSPC亞群成功在體內生成了功能性血小板，為難治性血小板減少症的治療和幹細胞移植結局的改善给予了可規模化的解決方案。而移植了共培養的HSPC-MSC-3D微環境的小鼠存活率達到80% ，而對照組小鼠全部死亡。

這意味着，一個精心設計的、化學成分明確的多孔微載體，完全可以在功能上替代AFT024或者OP9類器官，甚至给予更優越的造血支持微環境。

技術整合的協同效應

一個超越簡單加和的創新方案

將Liang和Li的研究成果與Hu等人的方案相結合，韦德国际可以預見一種超越簡單加和的協同效應：

信號通路的雙重激活：Liang等人證實的Notch信號激活，與Li等人證實的TPO信號上調，恰好覆蓋了淋巴細胞分化和HSPC擴增兩個關鍵環節。在同一個微載體系統中同時激活這兩條通路，有望實現「擴增-分化」的無縫銜接。

「零殘留」的細胞收穫：使用由明膠等生物材料製成的可溶解微載體，在NK細胞成熟階段開始前，只需加入特定的溫和酶，即可將微載體完全溶解，無損地釋放出所有細胞。這一策略在Liang等人的研究中已得到驗證。

從2D到3D的維度升級：將當前方案的類器官培養升級為3D微載體培養，不僅大幅增加了培養表面積，更顺利获得Li等人揭示的物理信號（剛度和孔徑）調控機制，為HSPCs给予了更接近生理狀態的發育微環境

生物反應器生產線：全封閉、自動化、陆续在流

如果將上述優化方案整合起來，韦德国际可以描繪出下一代iNK/CAR-iNK製造平台的完整圖景：

第一階段：生物反應器擴增

在攪拌式生物反應器中，將CD34+ HSPCs與培養在可溶解多孔微載體上的hMSCs進行共培養。借鑑Liang等人優化的物理參數（剛度≈11.2 kPa，孔徑≈80 μm），構建最適擴增微環境。3D微載體给予的巨大比表面積，使得在極小的空間內實現HSPCs的超大規模擴增成為可能。

第二階段：原位誘導分化

顺利获得合適的大孔過濾膜將微載體截流在反應器內，把擴增後的懸浮CD34+ HSPC或CAR-HSPC轉移至新一級的生物反應器中，加入新的不含hMSCs的3D微載體，並更換培養基成分（撤除擴增因子，加入分化因子），直接在生物反應器中啟動向NK細胞譜系的定向分化。此時，微載體给予的仿生物理結構和表面性質，顺利获得激活Notch信號通路（Liang等人證實的關鍵機制），接替了OP9細胞的功能，引導HSPCs高效特化。

第三階段：微載體溶解與終末培養

當細胞完成譜系定向後，向生物反應器中加入特定酶，將微載體完全溶解。釋放出的NK前體細胞被轉移或直接灌流至透氣培養袋中或新的下一級生物反應器中，在IL-15和IL-2的驅動下完成最後的成熟和擴增。

Hu等人的研究為「現貨型」CAR-NK細胞療法给予了關鍵的「數量藍圖」——它證明了從一個幹細胞出發，生產出足以惠及數百名患者的細胞劑量是完全可行的。而顺利获得整合Liang等人和Li等人在仿生3D微環境領域的突破性成果，韦德国际則可以為其配套一套符合GMP規範的「質量與安全基礎設施」。

值得一提的是，這些前沿的仿生微環境構建方案，正可依託於韦德国际生物给予的已實現商業化驗證的核心耗材。其GMP級3D TableTrix™ 明膠微載體和3D RecomTrix™ 重組膠原蛋白微載體，憑藉藥用輔料備案資質和在上市MSC藥品中的成功應用，結合全自動化一次性生物反應器、全封閉自動化的細胞處理系統、罐裝系統以及優秀的MSC無血清培養基和NK無血清培養基，為從實驗室工藝向大規模、封閉式自動化生產的無縫轉化给予了堅實可靠的「工業基石」。

從依賴小鼠飼養層的「手工精釀」時代，邁向基於人源化材料和精確工程化3D微環境的「工業化釀造」時代，NK細胞的製造工藝正在經歷一場從底層邏輯到上層建築的深刻變革。這不僅將大幅降低CAR-NK療法的成本，提高其可及性，更將為全球數百萬腫瘤患者帶來真正意義上的「現貨型」免疫療法新希望。正如王金勇研究團隊所展望的，這套一體化工藝為 affordable（可負擔的）、off-the-shelf（現貨型的）CAR-iNK療法鋪平了通往臨床轉化的可行路徑。

參考文獻

[1] Hu, F., Li, J., Wang, Y., Lin, Y., Zhang, J., Xu, J., Zheng, X., Weng, Q., Liu, X., Geng, Y., Wu, H., Liu, L., Peng, H., Wu, B., Huang, D., Xia, C., Wang, T., Du, X., Zeng, H., ... Wang, J. (2025). Large-scale generation of iNK and CAR-iNK cells from CD34+ haematopoietic stem and progenitor cells for adoptive immunotherapy. Nature Biomedical Engineering, 1-20.

[2] Li, Y., He, M., Zhang, W., Liu, W., Xu, H., Yang, M., & Gao, Y. (2023). Expansion of human megakaryocyte-biased hematopoietic stem cells by biomimetic Microniche. Nature Communications, *14*(1), Article 2207.

[3] Liang, H., Ao, Y., Li, W., Liang, K., Tang, B., Li, J., Wang, L., & Du, Y. (2023). Injectable bone marrow microniches by co-culture of HSPCs with MSCs in 3D microscaffolds promote hematopoietic reconstitution from acute lethal radiation. Bioactive Materials, *22*, 453-465.

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