隨着NK細胞療法在血液瘤和實體瘤治療中展現出日益重要的潛力，如何穩定、高效、規模化地取得大量高活性、臨床級的NK細胞，已成為整個行業的核心技術壁壘。與T細胞不同，NK細胞的體外擴增更為複雜和挑剔，其活化需要整合多種激活和抑制信號的平衡。

本文將帶您深入NK細胞生產的「廚房」，詳細解析從經典的飼養層細胞共培養法，到前沿的無飼養層化學限定體系的演進，並重點闡述在這一過程中，那些指揮NK細胞生長、分化與殺敵的「指揮官」——細胞因子的具體功能。

NK細胞的「三大兵工廠」

在探討具體的培養方法之前，第一时间需要明確NK細胞的來源。现在，用於治療研究的NK細胞主要來源於三路大軍：

外周血源性NK細胞（PB-NK）：從健康供者的外周血中分離取得。這是最經典的來源，表型成熟，殺傷功能強。但缺點是數量稀少（僅占外周血淋巴細胞的5-15%），供者異質性大，且難以進行基因編輯。

臍帶血源性NK細胞（CB-NK）：從臍帶血中直接分離取得，優勢和缺點與PB-NK相似。另一種方法是從臍帶血中分離CD34+造血幹細胞和祖細胞（HSPCs），再定向誘導分化為NK細胞。臍帶血來源豐富，細胞更為原始，增殖潛力巨大，是製備「現貨型」細胞產品的理想原料。

幹細胞源性NK細胞：包括從人胚胎幹細胞（hESCs）或誘導多能幹細胞（iPSCs）分化而來的NK細胞（iPSC-NK）。這是當前的研究熱點，iPSC可以實現無限擴增、易於進行基因工程改造（如引入CAR），能夠實現真正意義上的均一化、標準化生產。

傳統方法：飼養層細胞依賴性擴增

在很長一段時間內，取得足夠數量NK細胞的金標準是使用飼養層細胞進行共培養。飼養層細胞通常經過γ射線照射處理，使其失去增殖能力，但仍能代謝存活，並顺利获得表面表達的多種共刺激分子和膜結合型細胞因子，為NK細胞给予強烈的活化信號。

最廣泛使用的飼養層細胞是基因工程化的K562細胞。K562是一種慢性髓系白血病細胞系。

科學家們顺利获得基因改造，讓K562細胞過表達4-1BB配體（4-1BBL）、膜結合型IL-15（mbIL-15）或膜結合型IL-21（mbIL-21）等分子。這些經過改造的K562細胞（GeK562）能夠極大地促進NK細胞的擴增。例如，表達mbIL-21的K562細胞，在21天的共培養中能實現超過2000倍的NK細胞擴增（Motallebnejad et al., 2025）。

然而，飼養層細胞法存在先天缺陷：

監管風險：最終產品中混有哪怕極少量未被完全清除的腫瘤來源飼養細胞，都可能帶來致瘤風險。

質控難度：飼養層細胞本身的質量、培養和儲存條件需要極其嚴格的管理，批次間一致性難以保證。

工藝複雜性：生產過程繁瑣，難以大規模封閉自動化生產。

因此，開發不依賴於飼養層細胞、成分明確、符合藥品生產質量管理規範（GMP）的無飼養層培養體系，成為產業界和監管组织共同追求的目標。

無飼養層體系：從「依賴」走向「自主」

無飼養層培養的核心，是顺利获得優化培養基配方和補充外源性因子，模擬甚至超越飼養層細胞给予的信號環境。现在的策略主要分為以下幾類：

優化的細胞因子組合

細胞因子是調控NK細胞命運的「化學語言」。研究發現，某些細胞因子是「必需品」，單獨使用即可誘導增殖；而另一些則是「增效劑」，必須與必需品組合才能發揮最大效能。

基礎組合：IL-2和IL-15是NK細胞體外擴增的基石（Ma et al., 2024; Sun et al., 2003）。它們是維持NK細胞生存和基礎增殖的「必需品」。然而，單用IL-2或IL-15的擴增效率有限。

增效組合：IL-21是一個典型的「增效劑」（Spolski & Leonard, 2008）。單獨使用IL-21無法誘導NK增殖，但在培養初期短暫聯合IL-15使用，可以將擴增效率提升2-10倍（Nutt et al., 2004）。這是因為IL-21主要在早期起作用，其信號效應能持續影響整個擴增過程。

其他輔助因子：IL-12和IL-18通常在活化後期加入，旨在增強NK細胞的IFN-γ分泌能力和細胞毒性，而非單純追求數量擴增（Ohno et al., 2025）。IL-27也被證明與IL-15聯合使用，可以提高NK細胞的擴增倍數和激活受體表達。

抗體刺激法

借鑑T細胞培養中使用CD3/CD28抗體的成功經驗，研究人員也在探索用抗體來特異性激活NK細胞。

CD3抗體（OKT-3）的「意外」效果：OKT-3雖然靶向T細胞，但在外周血單個核細胞（PBMC）培養體系中加入OKT-3，卻能有效促進NK細胞增殖（Satwani et al., 2011）。其機制在於，OKT-3第一时间激活了T細胞，活化的T細胞分泌的大量細胞因子（如IL-2）進而「餵養」了NK細胞。

靶向NK激活受體：更直接的策略是使用靶向NK細胞表面激活受體的抗體。例如，聯合使用抗CD2抗體和抗NKp46抗體，配合IL-2、IL-12、IL-18和IL-21的細胞因子雞尾酒，可以選擇性地從PBMC中高效擴增出高純度的NK細胞（Lim et al., 2012）。

抗CD16抗體：CD16（FcγRIII）是介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）效應的關鍵受體。特定的抗CD16激動性抗體也能激活NK細胞，並提高擴增後的NK細胞純度。

新一代技術：納米顆粒與3D培養

為了進一步實現規模化、標準化生產，納米技術和生物材料正在與細胞培養工藝深度融合。

納米顆粒：可以模擬飼養層細胞给予的接觸性信號。例如，將激活NK細胞的信號（如抗NKG2D抗體、IL-15融合蛋白）偶聯到磁性納米珠或可降解的納米顆粒表面，為NK細胞给予人工的「抗原呈遞」刺激。這種策略不僅能高效擴增NK細胞，還能避免生物污染，且納米顆粒易於顺利获得洗滌去除。

生物材料與3D培養：模擬骨髓或淋巴結的3D微環境，為iNK細胞的分化或/和NK的增殖给予更仿生的物理支撐和細胞間相互作用。

核心細胞因子功能詳解

在NK細胞的整個生命周期中，不同的細胞因子扮演着截然不同的角色。下表總結了在NK細胞培養過程中最常見的關鍵細胞因子及其核心功能：

從iPSC到NK細胞的標準化生產案例

以现在備受關注的iPSC-NK分化為例，韦德国际來看一個典型的無飼養層培養流程(Zhu & Kaufman, 2019）。本方案的核心在於：

① 完全擺脫飼養層和基質細胞，避免動物源污染；

② 兩階段液體培養，流程清晰，便於工藝放大。

第一階段：第0–11天——造血分化（擬胚體法）

第11天終點：收集EB，可取得富含CD34+造血前體細胞的群體，作為下一階段NK定向分化的起始細胞。

第二階段：第11天–第4周——NK定向分化

第4周終點：流式檢測顯示CD56+CD3-細胞比例通常>80%，這些細胞表達NKG2D、NKp46等激活受體，並具備細胞毒性功能 。

第三階段：第4周-第8周——NK臨床規模擴增

雖然Zhu等人（2019）建議在取得第4周的NK細胞後，可顺利获得與輻照後的mbIL-21-K562細胞共培養實現大規模擴增，以達到臨床治療所需的細胞數量。然而，從臨床級製備的安全性和質量可控性角度考量，韦德国际更推薦採用無飼養層、化學成分明確的擴增方案（Nakazawa et al., 2023）。該方案顺利获得抗體包被（抗NKp46和抗CD16）给予活化信號，完全擺脫了對飼養層細胞的依賴，避免了致瘤風險和批間差異，更符合當前細胞療法的工業化生產標準。

需要說明的是，此擴增步驟屬於生產流程的延伸和放大階段，並非基礎分化流程的組成部分，因此可以與Zhu & Kaufman（2019）的iPSC-NK分化流程無縫銜接。雖然Nakazawa等人的原始方案基於臍帶血來源的NK細胞，但其無飼養層、抗體包被的核心技術平台同樣適用於iPSC-NK的後續擴增，代表了下一代「即用型」細胞產品的开展方向。

關鍵結果：該方案在21天的擴增周期內，可取得>99%純度的CD3-CD56+ NK細胞，且細胞高表達LFA-1、NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp46等激活受體，對膠質母細胞瘤細胞系T98G具有顯著的細胞毒性作用 。

值得一提的是，雖然上述無飼養層擴增方案在實驗室研究中表現出色，但實際轉化過程中，自行配製多種細胞因子、包被抗體並進行質量控制，往往意味着繁瑣的操作流程和多個物料的質量管控負擔——這對於希望快速推進管線的研發團隊而言，是實實在在的隱性成本。

NK細胞治療研究和開發企業可以選擇購買商業化的擴增試劑盒來加速。比如韦德国际生物的3D FloTrix® NK細胞無血清培養基套裝（型號：RNK59）以即用型形式给予，而以iPSC分化來源的NK細胞本就純度>99%，韦德国际的擴增試劑盒可保持高純度的情況下、實現擴增倍數>1000倍的穩定表現，讓企業將寶貴精力聚焦於上游創新與臨床轉化，同時可以取得：

成分限定：純因子法，無動物源，無需飼養層；

免去繁瑣配製：所有組分經過嚴格配比測試，無需自行摸索濃度；

降低質控負擔：單一試劑盒採購，就覆蓋包被、激活和擴增所需物料，減少多物料供應商管理成本；

優異的性能：科學優化過的多因子配方，平衡擴增效率、純度和殺傷能力。

從依賴飼養層細胞的「手工小作坊」時代，邁入無飼養層、成分明確、自動化封閉的「工業化大生產」時代，NK細胞的體外製造工藝正在經歷一場深刻的變革。對細胞因子網絡的精準理解和運用，以及對新型生物材料的交叉融合，正在不斷降低NK細胞療法的成本，提高其可及性。掌握這些核心培養技術，將是未來在激烈的細胞治療市場競爭中脫穎而出的關鍵。

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