前言

肌腱是一種典型的細胞稀少型組織，內源性幹細胞數量匱乏，這一特性嚴重製約了損傷後肌腱組織結構的高效再生與運動功能的全面恢復。

现在，在再生醫學領域的前沿探索中，基於患者特異性幹細胞衍生的類器官已在腸道、肝臟等多器官的研究中展現出優異的移植修復潛力。這類「定製化」類器官不僅能規避供體短缺的難題，有效降低免疫排斥風險，還能模擬天然器官的結構與功能，為再生治療给予全新思路。也正因如此，體外工程化構建大規模、可移植的幹細胞來源類器官，被公認為再生醫學領域極具前景的开展方向。

然而，當前類器官的臨床轉化卻面臨「尺寸差異」這一關鍵難題。現有研究中的類器官多為毫米級，與臨床移植所需的厘米級人體組織尺度相差甚遠。因此，如何突破尺度限制，開發出具備人體組織尺寸的功能性類器官，已成為有助于其走向臨床移植應用的核心問題。

這一關鍵難題的突破，近期迎來重要進展。浙江大學茵梓及陳曉團隊針對上述「尺度突破」問題展開系統性研究，相關成果發表於國際權威期刊Advanced Science（影響因子：14.1），論文標題為「Centimeter-Scale Self-Assembling Tendon Organoids Drive Tissue Regeneration」（厘米級自組裝肌腱類器官驅動組織再生）。

研究人員提出「優化化學信號調控+仿生3D微載體」的協同策略，顺利获得復現肌腱發育關鍵因素，並利用3D多孔微球載體，成功構建出類似天然肌腱的厘米級肌腱類器官。該策略不僅為肌腱修復给予了高性能移植物，更為實現大規模、可移植類器官的臨床轉化探索出新路徑。

原文連結：http://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202509453

研究背景

在類器官尺度突破的探索中，肌腱憑藉其相對簡單的細胞構成，成為構建大規模幹細胞來源類器官的理想研究模型。其中，肌腱干/祖細胞（TSPCs）是核心突破口——作為肌腱組織中特有的幹細胞群體，它兼具多能性、自我更新能力及肌腱生成表型，天然就是肌腱形成與再生的「種子細胞」。

不過，臨床應用的前提是要在極少量活檢樣本基礎上，實現TSPCs的指數級擴增。而傳統含血清培養基批次效應顯著、成分複雜且難以精準調控，極易導致細胞功能下降，因此開發成分明確的定製化培養基迫在眉睫。更為關鍵的是，細胞功能的穩定維持不僅依賴化學信號調控，還需要體內複雜物理微環境的支撐，僅靠化學信號遠不足以滿足厘米級肌腱樣類器官的發育需求。

細胞貼附在3D TableTrix® 微載體上進行三維培養

面對這一困境，韦德国际生物3D TableTrix® 微載體（MSs）展現出獨特優勢。該載體不僅具備高孔隙率與優異生物相容性，其內部含有的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸（RGD）肽序列還能直接促進膠原組裝；同時，一方面增強幹細胞黏附能力，给予適宜的機械支撐與剛度，另一方面顺利获得擴大比表面積，觸發TSPCs的正向分化信號。尤為重要的是，其多室結構有效解決了傳統培養中的營養滲透難題，使營養物質得以順利擴散至組織內部，為厘米級微組織的形成给予關鍵保障，較好地模擬了體內生理環境與自然組織結構。

研究設計

本研究顺利获得優化化學信號，並利用仿生3D微載體模擬肌腱細胞外基質（ECM），最終成功開發出長度超過3cm、符合人體組織尺度的可移植肌腱類器官。

研究人員將分離純化後的TSPCs接種於韦德国际生物3D TableTrix® 微載體上進行培養，使其在體外自組裝形成類似天然肌腱結構的類器官。隨後，將TSPCs與3D微載體分離，用於評估細胞活力與增殖能力；比較2D培養組與3D微載體組中TSPCs向成骨、成脂和成軟骨譜系的分化能力；並顺利获得流式細胞術、顯微鏡觀察及各類染色方法評估類器官的形態和功能。同時，利用scRNA-seq和RNA分析，系統刻畫肌腱類器官的基因表達譜及譜系分化特徵。最後，將達到標準的肌腱類器官移植至動物肌腱損傷部位，觀察其在體內的存活情況以及對組織再生的促進作用。

研究內容

3.1 定製培養條件下肌腱類器官的設計與製造

研究人員利用3D MSs結合優化的生化培養條件（圖1），生成厘米級的宏觀肌腱樣組織。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，由明膠組成的3D MSs具有相互連通的微孔結構，孔徑約為10–30 μm，整體直徑接近200 μm，為細胞黏附和增殖给予了充足空間，使細胞在培養過程中既能維持細胞–細胞相互作用，又能實現細胞–ECM的充分接觸，從而對TSPCs展現出強黏附性和優異生物相容性。

圖1. 基於TSPCs的三維類器官工程示意圖

活/死細胞染色結果證明，MSs中細胞活力和增殖狀況良好（圖2）。

圖2.活/死細胞染色結果

（A）活/死細胞染色代表性圖像；

（B）類器官組中TSPCs在第1、3、5和7天的細胞活力情況

在類器官培養的肌腱特異性條件下，在未對MSs進行消化的前提下，CCK-8檢測結果顯示，類器官組的增殖活性顯著高於傳統TSPCs組；DAPI核染色結果也從形態學層面直觀證實，隨培養時間延長，細胞群體呈現明顯擴增趨勢，且MSs上的TSPCs逐漸融合併自組裝形成微觀肌腱樣結構（圖3）。

圖3.類器官培養體系促進肌腱幹細胞增殖與自組裝形成

（A）培養1、3、5和7天後，類器官組與對照TSPCs組的細胞增殖率比較。

（B）SEM圖像顯示類器官組中TSPCs在第3、5和7天的自組裝與增殖形態。綠色為微載體支架，黃色為腱細胞。（比例尺：20 µm，50 µm）

體外肌腱形成能力評估結果進一步驗證了該體系的優勢：透射電鏡（TEM）觀察表明，肌腱類器官組的膠原纖維組裝更為明顯，而在2D培養的TSPCs組中，僅能觀察到較少且細長的膠原原纖維（圖4D–F）。F‑肌動蛋白免疫熒光染色結果則顯示，類器官中TSPCs的細胞形態更加緊湊，細胞面積和體積減小，核質比和球形度均有所改善，呈現出更接近天然肌腱細胞的表型特徵（圖4A、B）。

經過28天定製化培養後，研究團隊成功取得長度超過3 cm的肌腱樣微組織（圖4C）。這些結果表明，肌腱類器官能夠在體外實現高細胞活力、高效細胞擴增，並自組裝成微組織，充分彰顯其在體外模擬天然肌腱形成過程中的突出潛力。

圖4.肌腱類器官在體外形成功能性膠原結構與三維微組織

（A、B）類器官組（n=4）和對照條件組（n=4）在培養4天後，F‑肌動蛋白（Phalloidin）染色的代表性共聚焦圖像及細胞核質比、細胞面積的定量分析。（比例尺：60 µm）

（C）培養28天後長度約3 cm的肌腱類器官整體視圖。

（D–F）TEM顯示體外類器官組（n=4）和對照組（n=4）中膠原纖維的縱向切片和橫截面圖像，類器官組膠原纖維直徑範圍明顯更大。

3.2 厘米級TSPCs微組織的系統評估

對TSPCs聚集形成的厘米級微組織進行系統評估後發現，所構建的肌腱類器官不僅具備形成完整微肌腱結構的能力，同時高水平表達典型肌腱生成標誌物及年輕態相關標誌物（圖5）。

圖5.肌腱類器官在體外培養中自發聚合併呈現年輕態特徵

（A）肌腱類器官示意圖及外觀。

（B、C）第0、3、7和14天類器官中TSPCs染色Lamin B1的熒光顯微圖像及其平均熒光強度、陽性率和每個微球細胞數量的定量分析（n=3）。（比例尺：40 µm）

（D、E）第0、3、7和14天類器官中TSPCs染色Col3的熒光顯微圖像及相應定量分析。（比例尺：40 µm）

（F、G）第0、3、7和14天類器官中TSPCs染色EGR1的熒光顯微圖像及定量分析（n=3）。（比例尺：40 µm）

（H、I）第0、3、7和14天類器官中TSPCs染色MKX的熒光顯微圖像及平均熒光強度、陽性率和每個微球細胞數量的定量結果。（比例尺：40 µm）

（J）第14天體外未誘導肌腱類器官中EGR1、EYA2、Lamin B和Nestin的免疫熒光共聚焦代表圖像。

（K、L）工程化類器官的光片顯微鏡圖像，COL1和COL3染色。（比例尺：500 µm）

3.3 TSPCs來源肌腱類器官的多能性與抗衰老特性解析及轉錄組揭示的強效肌腱向分化特徵

為明確肌腱類器官擴增過程中TSPCs的幹細胞特性，研究團隊顺利获得多譜系分化能力檢測及TSPCs表面標誌物表達分析進行了系統評估。結果顯示，類器官中的TSPCs經陆续在傳代後，仍能穩定保留幹細胞潛能，並表現出優異的多譜系分化能力及再生特性。

轉錄組測序分析進一步從分子層面揭示其優勢：類器官體系中的TSPCs在轉錄水平上持續維持強大的分化調控與自我更新潛能。這一結果充分凸顯了類器官體系在受控體外環境中，對複雜肌腱微組織精細形成及再生過程的高效模擬能力（圖6）。

圖6.大鼠肌腱組織的轉錄組結果

（A）主成分分析（PCA）圖，顯示類器官組（n=3）在3天時與對照組（n=3）的明顯分離。

（B）基於rlog轉換值構建的樣本間距離熱圖。

（C）類器官培養與對照培養TSPCs之間的差異表達基因（DEGs）火山圖（類器官vs TSPCs；log2倍數變化>1.5或<−1.5；p<0.05；n=3）。

（D）與肌腱生成、骨化和炎症相關的DEGs熱圖，顏色從藍到紅代表基因表達水平由低到高。

（E）類器官組與對照組TSPCs中TPPP3、EGR1、FOS、NES、ACAN、SOX9、MMP3和ADAMTS5的mRNA表達水平（n=3）。

（F）與對照組相比，類器官組中富集的生物學過程（GO）分析。

（H）腱相關基因的基因集富集分析（GSEA）。NES=標準化富集評分；FDR=假髮現率。

（G）第4天從類器官組和對照組分離的TSPCs的Nes和Lamin B免疫熒光染色（類器官來源TSPCs vs常規培養TSPCs）。（比例尺：30 µm，20 µm）

3.4 TSPCs來源類器官的高肌腱成熟度及肌腱特異性譜系體外定向分化特性

對肌腱類器官中細胞狀態的系統表徵結果表明，該體系不僅能夠在體外高效誘導細胞向肌腱特異性譜系定向分化，更重現了從幹細胞到成熟腱細胞的體內自然分化進程，為其作為肌腱類器官研究的穩健模型给予了充分驗證（圖7）。

圖7.單細胞測序揭示類器官組呈現介於體外培養肌腱幹細胞與天然人體肌腱組織之間的過渡狀態

（A）TSPCs培養的三種條件示意圖：類器官、二維培養TSPCs和三維MSs培養TSPCs。

（B）來自二維、三維和類器官組整合數據的UMAP可視化。

（C）各細胞簇標記基因的點圖。

（D、E）細胞亞群比例分佈圖。

（F、G）標記基因的特徵圖。

（H、I）Cytotrace分化潛能分析圖。

（J）整體腱細胞表型評分。

（K）整體腱標記基因表達的點圖。

3.5 基於單細胞轉錄組分析：肌腱類器官—體外培養細胞與天然肌腱組織的中間狀態

在系統評估肌腱類器官與天然肌腱組織的分子相似性時，研究人員發現：類器官呈現出介於體外培養TSPCs與天然肌腱組織之間的過渡性分子特徵——既具備更高的成熟度以模擬天然組織功能，又保留了充足的增殖潛力以支撐再生需求，為肌腱再生研究及組織工程轉化给予了極具價值的模型（圖8）。

圖8. 該類器官展現出卓越的肌腱成熟度，成功實現了SCX譜系的體外分化

（A）TSPCs在三種條件下的培養示意圖：類器官、人新生兒腱和成人腱。

（B）來自2D、僅3D支架、類器官組、人新生兒腱和成人腱的腱相關亞群整合數據的UMAP可視化。

（C）各樣本細胞亞群比例分佈圖。

（D）各群簇標記基因點圖。

（E）按群簇繪製的Cytotrace分化潛能圖。

（F）按樣本繪製的Cytotrace分化潛能圖。

（G、H）群簇1和群簇4的GO富集分析。

（H）標記基因的RidgePlot。

（I）標記基因的特徵圖。

3.6 肌腱類器官顺利获得富集ECM組分增強自組裝

為深入解析類器官維持細胞功能、抑制表型丟失的潛在調控機制，研究人員進一步召开了RNA測序（RNA-seq）分析。結果表明，肌腱類器官的細胞活性及其向肌腱譜系的定向分化潛能，核心依賴於ECM富集信號；該信號顺利获得下游細胞骨架調控通路發揮作用，進而介導細胞組裝過程並調控分化潛能（圖9）。

圖9.類器官顺利获得富集ECM成分與激活F-肌動蛋白協同促進組織形成

（A）與對照組相比，類器官組中ECM與幹細胞相關生物學過程的GO富集分析。

（B）ECM相關通路的GSEA分析。

（C）ECM相關DEGs熱圖，顏色從藍到紅表示基因表達水平從低到高（n=3）。

（E）類器官組與對照組TSPCs的COL6A1、COL10A1、DES、EPHA4、ECM1、COL13A1、COL6A2、SDC1、THBS2和CCN2的mRNA表達水平（n=3）。

（G）類器官組、TSPCs組及體內TSPCs的細胞骨架形態。

（D–G）代表性共聚焦圖像顯示，在DMEM與Y27632處理條件下，EGR1、Nes和Lamin B的免疫熒光染色結果及陽性率的量化分析。

3.7 TSPCs類器官增強移植幹細胞滯留效率並促進肌腱組織快速再生

為驗證TSPCs類器官在體內促進肌腱再生的實際效能，研究人員第一时间將其移植至裸鼠背部區域，重點評估幹細胞在體內的滯留效率。結果顯示，類器官移植組再生肌腱的結構完整性與力學性能均顯著優於2D培養TSPCs組及單純3D多孔微載體（MSs）組。這一結果充分證實，處於類器官微環境中的TSPCs能顯著增強肌腱再生能力。相較於直接植入TSPCs的傳統策略，肌腱類器官移植更有利於驅動肌腱修復進程（圖10、圖11）。

圖10. TSPCs類器官在術後2周的肌腱再生能力分析

（A） 植入裸鼠背部區域的肌腱類器官熒光成像（n=4）。

（B）類器官在SD大鼠髕腱缺損模型中植入的示意圖。

（C）術後2周修復大鼠髕腱的H&E染色、Masson染色及偏光顯微鏡圖像。比例尺：100 µm（H&E和Masson），200 µm（偏光）。

（D）大鼠修復腱的組織學評分（n=5）。

（E、F）修復膠原纖維橫切面和縱切面的TEM圖像；（E）膠原纖維平均直徑，（F）膠原纖維直徑頻率分佈（n=5）。

（G）術後2周修復腱的DiI免疫熒光染色及統計分析。

圖11. TSPCs類器官在術後4周的肌腱再生能力分析

（A）術後4周修復大鼠髕腱的H&E、Masson和偏光顯微鏡圖像。比例尺：100 µm（H&E和Masson），200 µm（偏光）。

（B）大鼠修復腱的組織學評分（n=5）。

（C）修復腱組織膠原含量分析（n=5）。

（D–F）修復膠原纖維橫截面和縱截面的TEM圖像。（比例尺：200 nm）

（G）術後4周修復再生腱的DiI免疫熒光染色。（比例尺：50 µm）

（H）術後4周再生腱的機械性能（剛度、拉伸強度和楊氏模量）（n=8）。

（I）術後4周修復再生腱的Col1和TNMD免疫熒光染色。（比例尺：50 µm）

研究結論

總之，本研究首次成功構建了厘米級肌腱類器官，在體外顯著促進TSPCs的增殖和分化，並增強其年輕化特性。值得強調的是，3D多孔微載體（MSs）作為核心支撐體系，憑藉其高孔隙率、優異生物相容性及表面活性肽序列，為TSPCs给予了仿生微環境：一方面顺利获得擴大比表面積提升細胞黏附與擴增效率，另一方面依託多室結構保障營養滲透，為ECM沉積及類器官自組裝奠定了關鍵物理基礎。正是這種「化學信號調控+3D載體支撐」的協同模式，實現了TSPCs增殖與分化的精準平衡，高效驅動主體細胞擴增及微組織自組裝。

體內實驗進一步證實，該肌腱類器官在移植後滯留以及損傷肌腱結構和功能再生方面均帶來顯著改善。該創新策略為肌腱組織工程與再生醫學領域的臨床轉化给予了全新技術路徑，展現出巨大應用潛力。

  研究應用材料及設備

作者介紹

通訊作者：浙江大學茵梓及陳曉團隊

共同一作：方添順，張鴻，謝源浩

【關於韦德国际】

北京韦德国际生物科技有限公司创建於2018年，由清華大學生物工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學科技成果轉化，並憑藉此項技術榮登中國科協「科創中國」先導技術榜。作為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業、潛在獨角獸企業，更取得國家科技部多項重點研發專項支持。

作為高質量三維細胞製造專家，韦德国际生物给予基於3D微載體的一站式定製化細胞規模化擴增整體解決方案，打造了原創3D細胞智造平台，實現規模化、自動化、智能化、密閉式的細胞藥物及其衍生品生產製備，以此幫助全球客戶建立最為先進的細胞藥物生產線。在開創【百億量級】幹細胞製備工藝管線後，加速向【千億量級】進發，致力於以3D細胞規模化智造技術賦能細胞與基因治療產業，惠及更多患者。